【2025药典抢先看】0512高效液相色谱法修订内容整理

       2023年4月24日，国家药典委员会官网发布“关于通则0512高效液相色谱法修订草案的公示”，拟对2020年版《中国药典》第三部第456页暨第四部第61页收入的方法——0512高效液相色谱法部分内容进行修订，公示期自发布之日起3个月。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，以下简称HPLC）是色谱法的一个重要领域之一，HPLC具有分析速度快、分离效能高、检测灵敏度好等特点，已成为化学、医药工业等学科领域中重要的分离分析技术应用。

       一、了解色谱法常用专业术语

       1.高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，以下简称HPLC）：

       是指采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

       2.色谱分析法（Chromatography）：

       简称色谱法或层析法，是一种物理或物理化学分离分析方法，该法利用某一特定的色谱系统（薄层色谱、高效液相色谱或气相色谱等系统）进行混合物中各组分的分离分析。

       3.固定相：

       在色谱分离中固定不动，对样品产生保留的一相。

       4.流动相：

       带动样品向前移动的另一相。

       5.保留时间(retention time，tR)：

       定义为被分离组分从进样到柱后出现该组分最大响应值时的时间，也即从进样到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，常以分钟(min)为时间单位，用于反映被分离的组分在性质上的差异。

       二、常见的HPLC色谱柱，你知道几种？

       在药品检测领域，有“四大名谱”，它们分别为色谱、光谱、质谱、波谱，可以说只要有分析任务的地方都在使用色谱分析法，《0512高效液相色谱法》收载的常用的HPLC色谱柱种类，分别是：

       1)反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基硅烷键合硅胶等。

       2)正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

       3)离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

       4)手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

       三、新旧0512高效液相色谱法主要内容抢先看

       根据2020年版《中国药典》实施以来的反馈意见，结合各国药典色谱法通则的修订变化，此次有以下几项内容有发生变化，红色字体为删除内容，蓝色字体为增订内容变更主要内容对照如下：

       1．进一步完善色谱参数调整范围。

       （4）色谱参数调整品种正文项下规定的色谱条件（参数），除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当调整。

       若需使用小粒径（约2μm）填充剂和小内径（约2.1mm）色谱柱或表面多孔填充剂以提高分离度或缩短分析时间，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配，必要时，色谱条件（参数）可适当调整。

       色谱参数允许调整范围见表。

表一色谱参数允许调整的范围

       表 允许调整的色谱参数及范围

       注：F1为调整前原规定流速；F2为调整后流速；dc1为调整前原规定色谱柱的内径；dc2为调整后色谱柱的内径；dp1为调整前原规定色谱柱的粒径；dp2为调整后色谱柱的粒径；Vinj1为调整前原规定进样体积；Vinj2为调整后进样体积；L1为调整前原规定色谱柱柱长；L2为调整后色谱柱柱长；tR为峰保留时间；Wh/2为峰半高峰宽。

       2．增加滞留体积对梯度分离影响的描述。

       可通过相关软件计算表中流速、进样体积和梯度洗脱程序的调整范围，并根据色谱峰分离情况进行微调。

       调整后，系统适用性应符合要求，且色谱峰出峰顺序不变。通常，较小的填充剂粒径需增加线速度，较大的填充剂粒径需降低线速度，在按上表调整流速时，要注意仪器的压力限值。若减小进样体积，应保证检测限和峰面积的重复性；若增加进样体积，应使分离度和线性关系仍满足要求。

       对于梯度洗脱，柱尺寸（柱长和柱内径）改变导致柱体积改变，会影响控制选择性的梯度洗脱体积。可通过调整梯度洗脱体积使其与柱体积成比例。由于梯度洗脱体积是梯度时间（tG）和流速F的乘积，因此需要对每个梯度段的梯度时间进行调整，以保持梯度洗脱体积与柱体积的比值恒定（表示为L×dc2）。由原来的梯度时间（tG1）、流速、柱长和柱内径，按下式计算新的梯度时间（tG2）。

       tG2=tG1×(F1/F2)×[(L2×dc)/(L1×dc)]

       梯度洗脱条件的调整可分步进行：（1）根据L/dp调整柱长和粒径；（2）根据粒径大小和柱内径的变化调整流速；（3）根据柱长、柱内径和流速的变化，调整每个梯度段的梯度时间。

       若减小进样体积，应保证检测限和峰面积的重复性；若增加进样体积，应使分离度和线性关系仍满足要求。应评价色谱参数调整对分离和检测的影响，必要时对调整色谱参数后的方法进行确认。若调整超出表中规定的范围或品种项下规定的范围，被认为是对方法的修改，需要进行充分的方法学验证。

       调整梯度洗脱色谱参数时应比调整等度洗脱色谱参数时更加谨慎，因为此调整可能会使某些峰位置变化，造成峰识别错误，或者与其他峰重叠。如梯度微调后仍不能满足系统适用性要求，通常应考虑滞留体积的缘故或更换色谱柱。

       滞留体积（dwell volume，用D或VD表示)，也称为梯度延迟体积，是指从流动相混合点至柱入口之间的体积。梯度洗脱时，所采用设备的配置可显著地影响方法所述的分离度、保留时间和相对保留时间。如果发生这种情况，可归因于过大的滞留体积。因此，应考虑方法开发时的系统与实际使用系统之间滞留体积的差异，在开始梯度程序前增加一个等度平衡阶段，通过调整等度阶段时间来调整梯度时间点，以与所使用的分析设备相适应。如在品种项下给出了方法开发时所

       用的滞留体积，则原梯度表中所述的时间点（t，min）可用按下式计算的调整后时间点（tc，min）代替：

       t_c=t- 

       式中D为实际使用的分析设备的滞留体积（ml）；

       D₀为方法开发时分析设备的滞留体积（ml）；

       F为流速（ml/min）。

       如验证证明分析方法应用时不需等度平衡，则可省略这一等度阶段。

       应评价色谱参数调整对分离和检测效果的影响，必要时对调整色谱参数后的方法进行确认。多个参数的调整将对系统性能产生累积影响，需要作适当的风险评估。

       对于组分或基质特别复杂的体系，如中药分析方法，进行其色谱参数调整时应特别谨慎。

       若调整超出表中规定的范围或品种项下规定的范围，被认为是对方法的修改，需要进行充分的方法学验证。

       3．在第一节增加（5）溶液制备的描述。

       （5）溶液制备 为减少溶剂峰和色谱峰的畸变，制备供试品溶液和参比物质溶液可用流动相（或梯度起始比例流动相组成）作为溶剂；为提高供试品中待测成分与参比物质的保留时间和峰面积响应的一致性，制备供试品溶液和参比物质溶液的溶剂组成尽可能保持一致。如供试品和/或参比物质在流动相中的溶解性不够，可先用流动相组成中具溶解能力的某一溶剂或其它适宜溶剂制备供试品溶液或/和参比物质溶液贮备液，再用流动相（或梯度起始比例流动相组成）稀释到测试的浓度。

       在测试序列中，应取制备溶液的溶剂和/或稀释剂进样以确认其是否对待测物质峰有干扰。

       对于含量测定，单点对照法定量用供试品溶液与对照品溶液浓度应相同或相近，确保在分析方法线性范围内，并有足够的精密度。

       对于限度检测，如有关物质检测，除另有规定外，供试品溶液浓度应保证能准确检测0.1%的杂质，对照溶液或对照品溶液浓度应与所关注的限度浓度相当。

       4．对系统适用性试验进行修订和补充：

       a.明确分离度（Rs）应以半高峰宽（Wh/2）的计算结果为准。

       （2）分离度（Rs）......无论是定性鉴别分析还是定量测定，均要求待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或特定的杂质对照色谱峰及其他杂质色谱峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5。分离度的计算公式为：

       式中tR2为相邻两色谱峰中后一峰的保留时间；

       tR1为相邻两色谱峰中前一峰的保留时间；

       W1、W2及Wh/2,1、Wh/2,2分别为此相邻两色谱峰的峰宽及半高峰宽，见下图。

       当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（Rs）均应以峰宽 （W）半高峰宽（Wh/2）的计算结果为准。

       b.增加峰谷比（p/v）作为系统适用性的参数。

       （3）峰谷比若待测物质峰与相邻峰之间未达到基线分离，如在有关物质检测时，峰谷比（p/v）可作为系统适用性试验参数。下图表示部分分离两个色谱峰的示意图，峰谷比值计算公式为：

       式中Hp为小峰平行外推基线的高度

       H为小峰和大峰间曲线最低点平行外推基线的高度。

       峰谷比值计算示意图

       c.定义灵敏度，修订信噪比（S/N）计算公式。

       （4）灵敏度用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比 （S/N）来表示。建立方法时，可通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。定量测定时，信噪比应不小于10；定性测定时，信噪比应不小于3。系统适用性试验中可以设置灵敏度实验溶液来评价色谱系统的检测能力。

       信噪比（S/N）用于定义系统的灵敏度，按下式计算：

       S/N=

       在使用规定的参比溶液获得的色谱图中， H为从目标峰最大值到基线信号的峰高，基线外延距离为目标峰半高峰宽的5倍；h距离为在目标峰5倍宽范围内观察到的最大和最小噪声的幅度，见下图。如可能，应平均分布在目标峰的两侧。

       通常，定量限的信噪比应不小于10，检测限的信噪比应不小于3。系统适用性试验中可以设置灵敏度试验溶液来评价色谱系统检测低含量成分的能力。

       d.重新对拖尾因子（T）作出规定。

       （4）（5）拖尾因子（T）

       除另有规定外，在检查和含量测定项下，以峰面积作定量参数时，T值应在0.8～1.8之间；以峰高作定量参数时，除另有规定外，T值应在0.95～1.05之间。

       以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的准确性，此时应在品种正文项下对拖尾因子作出予以规定。

       e.修订对重复性的要求。

       （6）重复性 用于评价色谱系统连续进样时响应值的重复性能。除另 有规定外， 通常取各品种项下的对照品溶液或其它溶液，连续重复进样 5 次， 其 峰面积响应测量值（或内标比值或其校正因子）的相对标准偏差应不大于 2.0% ， 如品种项下规定相对标准偏差大于 2.0% ，则以重复进样 6 次的数据计算。视进 样溶液的浓度和/或体积、色谱峰响应和分析方法所能达到的精度水平等， 以满足 检测所需的精密度要求为前提， 对相对标准偏差的要求可适当放宽或收紧，放宽 或收紧的范围以满足品种项下检测需要的精密度要求为准并在品种项下予以规定。

       f.增加保留时间和相对保留时间作为评价系统适用性参数的描述。

       （7）其他参数保留时间和相对保留时间常用于评价系统适用性，如在品种项下列出但未明确为系统适用性要求，它们仅作为一种参考。实验得到的相对保留时间与品种项下规定值间的差异应为多少，没有适用的可接受标准。

       g.对于复杂体系，提出可在品种项下附对照图谱来评价系统适用性。

       对于复杂体系，可在品种项下附对照图谱，通过供试品图谱与对照图谱的比对来评价系统适用性。

       上述系统适用性试验及其可接受标准，根据方法验证特别是耐用性试验结果在品种项下描述。如上述的与品种项下描述的系统适用性试验及其可接受标准不同，则以品种项下描述为准。

       除品种项下描述的任何其他系统适用性试验及其标准外，不论品种项下描述与否，用于检查或定量分析时，重复性试验应满足本通则或品种项下的要求。在整个分析过程中，色谱系统应满足系统适用性要求，否则实验结果不被接受。

       5．在测定法中增加校准曲线测定法。

       （6）校准曲线法

       对于复杂药物体系中的成分和/或待测成分量在较大范围变化的含量测定，可采用标准曲线法。标准曲线法可分为外标法和内标法。

       ①外标校准曲线法：精密称取对照品（或工作对照品）适量，或精密量取对照品储备液适量，配制成不同浓度的系列溶液，精密量取系列溶液各适量，进样，记录色谱图，测量峰响应，用峰响应对浓度绘制标准曲线，通过最小二乘法计算出回归曲线方程。在相同的色谱条件下，再精密量取供试品溶液适量，进样，记录色谱图，测量供试品溶液中待测成分的峰响应，由待测成分的峰响应和回归曲线方程确定供试品溶液中待测成分的量。

       ②内标校准曲线法：精密称取对照品（或工作对照品）适量，或精密量取对照品储备液适量，与精密量取的内标溶液混合，配成含等量内标物的不同浓度待测成分的系列溶液，精密量取系列溶液各适量，进样，记录色谱图，测量待测成分和内标物的峰响应比值，用峰响应比值对待测成分浓度绘制标准曲线，通过最小二乘法计算出回归曲线方程。在相同的色谱条件下，再精密量取加有与对照品系列溶液相同量内标物的供试品溶液，进样，记录色谱图，测量供试品溶液中待测成分和内标物的色谱峰响应比值，由待测成分的峰响应比值和回归曲线方程确定供试品溶液中待测成分的量。

       如适用，也可使用其他方法如标准加入法、内插法等，并在品种正文项下注明。

       参考文献

       [1]www.chp.org.cn