药审中心:<药物单次给药毒性研究技术指导原则>解读

作者:黄芳华(国家食品药品监督管理总局药品审评中心)

编辑:春雪

作者简介:黄芳华,女,博士,副主任药师,主要从事药品技术审评

工作。

[摘要] 单次给药毒性试验是药物非临床安全性评价的一部分。<药物单次给药毒性研究技术指导原则>于2014年5月发布,本文结合该指导原则的起草背景和专家讨论意见,对该指导原则内容进行详细解读,阐述药物单次毒性试验的基本技术要求。

2014年5月13日国家食品药品监督管理总局发布了<药物单次给药毒性试验技术研究技术指导原则>,为利于新药研究评价中全面理解该指导原则,本文结合该指导原则的起草背景和专家讨论意见,对该指导原则内容进行详细解读,阐述药物单次给药毒性试验的基本技术要求。

由于本指导原则将原“急性毒性试验”的名称更改为“单次给药毒性试验”,两个名称意义相同(下文阐述),因此本文中两名称通用。

1 指导原则修订目的

<药物单次给药毒性试验技术研究技术指导原则>(以下简称指导原则)作为一系列非临床安全性评价指导原则之一,于2012年启动合并修订工作,历时两年,经过广泛调研形成初稿、征询毒理专家意见和业界意见、召开专家讨论会等过程,最终形成正式稿并发布。本指导原则的修订目的是:

① 适应新药研发进展及研究评价的需要:原化学药和中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则于2005年发布,由于这些年来对急性毒性试验的认识不断深入和变化,原有的指导原则的一些内容已经滞后,与当前新药研究评价工作已经不相适应。

② 化药和中药、天然药物合并:从技术评价角度考虑,化学药和中药、天然药物在安全性研究评价技术方面无实质性差异,因此通过合并修订,统一技术规范。

2 指导原则修订背景

2.1国际背景

国际上对急性毒性试验的认识不断变化/进步,主要表现在急性毒性信息可从多种来源获得,可获得时可不要求单独的单次给药毒性试验。

LD₅₀法作为经典的急性毒性试验,曾经是各国药品注册法规的重要组成部分,在新药的开发注册中发挥了重要作用。但是该方法有其局限性:从生物学的角度看,LD₅₀ 没有恒定的数值,它是试验数学处理后计算产生的一个数值,具有不确定性,不同的试验条件、试验机构、研究中心对于同一药物所得出的结果差别较大;通常所用的剂量与临床人用剂量差别很大;人和动物对药物的敏感性差别很大,因此,如果以LD₅₀。值为参考进行后续临床剂量设计的精确计算,可能存在风险。1991年ICH会议达成共识,取消LD₅₀ 测定的常规要求,以剂量递增试验监测不同剂量下的毒性反应,可以用两种啮齿类动物或一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物的严格设计的、单次给药的、逐渐增加剂量的耐受性研究,取代啮齿类动物或非啮齿类动物LD₅₀ 。测定的要求。另一方面,LD₅₀ 法作为以致死性或危及生命毒性为终点的试验,需耗费大量动物,不符合3R原则及动物伦理原则。随着目前药物开发时间安排方式发生改变,毒理学试验通常分阶段序贯进行,急性毒性试验结果的参考价值越来越小。

近年来,国外制药工业界对急性毒性试验的认识提高,并逐渐达成一致。

2009年ICH(人用药品注册技术要求国际协调会)发布的M3(R2)指导原则 反映了国外药品监管三方(美国、欧盟、日本)对急性毒性试验新的、统一的认识。关于急性毒性信息的获得途径和药物非临床研究质量管理规范(GLP)的要求:急性毒性信息也可以从实施适当的剂量递增试验,或在常规毒性试验种属中确定最大耐受量(MTD)的剂量范围探索试验中获得。当急性毒性信息可从其他试验中获得时,不推荐再进行单独的单次给药试验。如果临床试验有适当的GLP重复给药毒性试验支持,提供急性毒性信息的试验可仅限于临床给药途径,而且这些信息可以从非GLP试验中获得。评价急性毒性的试验不应以死亡作为预期终点指标。但是,在某些特殊的情况下(如微剂量试验),急性毒性或单次给药试验可作为人体试验的主要支持,此时这些试验应在遵循GLP条件下进行。关于时间安排:应在Ⅲ期临床试验前完成,有助于预测用药过量可能的后果;用药过量高风险适应症,需要提前进行,如抑郁症、疼痛和痴呆等。

在ICH颁布三方协调的指导原则后,EMA(欧洲医药管理局)于2010年6月24日撤回单次给药毒性指导原则,并发布了<关于撤回单次给药毒性指导原则的问与答> 。该文件说明,ICH M3(R2)是撤回原单次给药毒性指导原则的管理和科学的基础;撤回主要是基于从传统单次给药毒性试验中所获得信息的价值有限,且急性毒性的信息可从其他类型毒性试验中所获得的认识。通过此举,将减少试验使用动物的数量,符合3R原则。EMA认为:在大多数情况下,急性毒性可根据来自于实施适当的剂量递增试验或短期的剂量范围试验中的资料进行评价;资料可来源于非GLP试验。EMA也列出了需要进行单独的单次给药毒性试验的特殊情况,这些情况下单次给药毒性试验是用于支持人类安全性评价的唯一试验,包括某些类型的探索性临床试验选项,或在某些治疗领域内的开发(如肿瘤药物)。为了这些目的而进行的单次给药急性毒性试验,需遵循“扩大”的单次给药毒性试验的设计,应在GLP条件下进行,并应遵守重复给药毒性试验指导原则中的原则。此外,单次给药毒性试验还可能为了一个特定的毒性终点指标提供机制性阐述而进行,这种情况下试验设计通常是针对性的。

2.2 国内背景

近10年来,国内对新药非临床安全性评价的认识不断进步,毒理学探索性研究的思路逐渐形成,试验水平不断提高,试验规范程度日益提高。但是,我国新药研发策略与国际存在差异,探索性研究的思路仍与国际存在一定差距。

单次给药毒性试验属于早期的毒理学试验,在新药毒理学研究中具有重要意义。它对初步阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义;试验所获得的信息对重复给药毒性试验的剂量设计和某些药物临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值,并能提供一些与人类药物过量所致急性中毒相关的信息。在现阶段,单次给药毒性试验仍是新药非临床安全性评价中的一部分,仍是常规的试验。

3 指导原则修订的基本原则

作为原有中药和化学药指导原则的合并修订,本指导原则以原指导原则为基础,原则上不改变原主旨和框架结构;将中药、化药共同原则合并,同时兼顾中药的特殊性。起草过程中,参考国外相关指导原则,引入国外对急性毒性试验的最新认识;结合我国新药研究的实际情况,力求新修订的指导原则具有科学性、可行性和前瞻性。

4 指导原则的关注要点

本部分介绍本指导原则一些需要关注的要点,特别是本指导原则与原指导原则的修订变更之处,结合这些变更的修订背景进行阐述。

4.1 试验名称的变更

本指导原则以“单次给药毒性试验(single dose toxicity study)”替代“急性毒性试验(acute toxicity study)”,是基于国际上名称的变化。在国外,以上两个名称都可采用,如FDA,EMA,ICH(ICH M3),并未达成明确的一致,两者通用但存在细微区别。但是,目前国外的新药申报资料中多采用单次给药毒性试验的名称,尤其是ICHCTD中的项目为“单次给药毒性试验”,而且单次给药毒性试验也可与也可与“重复给药毒性试验(re.peat dose toxicity study)”相对应,而国内也正在大力推行CTD格式的要求。在这种情况下,为与国际申报资料要求一致,确定将名称改为“单次给药毒性试验”。

为了利于理解,本指导原则开篇即明晰了概念,急性毒性是指“药物在单次或24 h内多次给予后一定时间内所产生的毒性反应”。狭义的单次给药毒性研究是“考察单次给予受试物后所产生的急性毒性反应”;单次给药毒性试验包括狭义和广义的概念,本指导原则所指为广义的单次给药毒性试验。通过这些阐述,以避免引起研究者的误解,如最大给药量法(多用于中药评价),为达到给药剂量足够高的目的,常采用1日内数次给药的方法,累积剂量法也是非典型的一次给药,这些试验非单次给药,属于广义的单次给药毒性试验。

4.2 适用范围的变更

本指导原则同时适用于中药、天然药物和化学药物。在指导原则起草过程中,兼顾中药和化学药,在中药和化学药需共同遵循的原则基础上,关注了中药的特殊性。中药方面的要求,与原指导原则比未作大的变更,具体要求详见指导原则附件(二)“不同情况的中药、天然药物单次给药毒性试验的要求。”

与化学药物相比,中药的特殊性体现在多方面,如给药剂量、所适用的方法等。由于中药、天然药物的预期临床用药剂量相对较高,因此单次给药毒性试验方法中所规定的剂量限度(如上下法中的2000或5000 mg~kg 的剂量限度)仅适用于化学药,中药、天然药物的剂量设计应综合考虑多方面因素进行确定。此外,由于大多数中药、天然药物的急性毒性可能相对较低,常常采用最大给药量(或最大耐受量法)进行急性毒性研究。

4.3 试验范围的扩大

试验范围的扩大是本指导原则重大变更之处。本指导原则引入了急性毒性信息的获得可从其他来源获得,并引入了“扩展的单次给药毒性试验”的概念。

“扩大”的单次给药毒性试验(“extended”sin—gle—dose toxicity study)在ICH M5(R2)中进行了定义 ,该试验应设计用于评价在单次给药后的血液学、临床生化学、尸体剖检以及组织病理学,在2周后对迟发毒性和/或恢复性进行进一步的评价。该种试验方式在国外申报资料中常见。目前国内已有多家GLP中心在进行急性毒性试验时也已增加观察指标,特别是大动物(如犬,)试验。通过这样的设计,可获得更多的急性毒性信息,并有助于设计后续的毒理学试验,因此值得鼓励。

4.4 GLP的要求

用于支持药品注册的单次给药毒性试验必须执行<药物非临床研究质量管理规范>(GLP)。其他来源的急性毒性信息试验亦要求执行GLP。

如前所述,在我国当前的研究背景下,单次给药毒性试验仍具有重要意义,因此,作为安全性评价的一部分,作为正式的申报资料,单次给药毒性试验必须执行GLP。

对于其他来源的急性毒性信息的试验要求,国外(如ICH,EMA)不强求在GLP条件下进行。但是,考虑到中国的国情,若试验条件缺乏控制,可能进一步影响结果的可靠性。这点在本指导原则起草过程中引起了争议,甚至讨论是否应删除“其他来源的急性毒性信息试验”的要求。考虑到急性毒性信息仍可从其他试验来(如重复给药毒性试验的前期剂量探索性试验),是值得鼓励的发展方向;同时考虑到资料的可靠性,最终达成一致意见,这些试验也要求GLP,要求规范的试验设计和严格的试验质量控制。

4.5 受试物的要求

单次给药毒性试验受试物的要求与其他毒性试验一致。起草过程中有意见提出,单次给药毒性试验常常处于毒理学试验的最早期,可能获得化合物时即会进行r一个早期急性毒性试验筛选,要求中试样品是否要求过高,是否有必要要求。针对这一点的考虑是:早期试验属于初筛,试验条件可能缺乏控制;在研发过程中,工艺等可能发生变化,影响纯度/含量/或杂质等,进而影响最终毒性。作为非临床安全性评价的一部分,单次给药毒性试验有其意义,因此,作为申报资料的安全性评价资料,需采用能代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品进行单次给药毒性试验。

4.6 试验方法的收录

试验方法收录与否是本指导原则起草过程中的一个重要议题。目前单次给药毒性试验有多种方法,每个试验室可根据受试物性质和试验需求进行选择,有部分试验室甚至选择的并不是这些经典方法,但是也能获得充分的急性毒性信息,这些方法也是可以接受的,从获得信息的角度值得鼓励。同时,作为指导原则,不是试验方法介绍。因此,最终确定本指导原则不写入具体的试验方法,仅在正文部分列出了常用的试验方法,如近似致死量法、最大给药量法、最大耐受量法、固定剂量法、上下法(序贯法)、累积剂量法(金字塔法)、半数致死量法等。研究者应根据受试物的特点选择合适的方法,根据不同的试验方法选择合适的剂量。

对于具体的试验方法,目前国内的GLP实验室技术能力已足以达到选择合适的方法、采用合理的设计来进行试验。同时,有很多相关的专业书籍、国外指导原则、文献资料可以参考借鉴,如OECD发布的一系列急性毒性试验指导原则。

值得关注的是,指导原则不写具体试验方法,并不意味着方法可以倒退,不意味着原指导原则收录方法或要求的作废。如最大给药量法,原2005年版指导原则对急性毒性试验的要求起了重要的规范和推动作用。如中药急性毒性试验,2005年前常见这样的试验,仅设1个给药组,药后观察7 d。2005年版指标原则出台后,方法规范为设置对照组,观察时间统一为一般14 d,并观察体重(体重是反映急性毒性的一个重要指标),这些要求依旧执行。

4.7 给药途径

本指导原则对给药途径的要求进行了更改,删除了对充分暴露的途径(如静脉途径)的必须要求。原指导原则规定“通常,给药途径应至少包括临床拟用途径和一种能使原形药物较完全进入循环的途径(如静脉注射)。如果临床拟用途径为静脉给药,则仅此一种途径即可。”本指导原则修订为“通常情况下给药途径应至少包括临床拟用途径。”

原指导原则要求两种途径的要求是基于给药途径不同暴露、获得初步的生物利用度的考虑。理论上,给药途径不同,受试物的吸收速度、吸收率和暴露量会有所不同,进行多种途径的急性毒性试验可获得更多的信息。但是,执行过程中遇到一些问题,有些申请人提出:开发的药物非注射给药途径,为何一定要进行注射给药途径的试验?药物不适合注射给药,这种情况下进行急性毒性试验有多大价值?

因此,在本指导原则合并修订时,对该问题进行了讨论。考虑到国外本身对急性毒性试验的弱化,以及随着新药研发的进步,早期一般都会进行生物利用度研究,无需急性毒性试验承载研究初步生物利用度的任务。因此,最终确定为:通常情况下需进行临床拟用途径一种给药途径的单次给药毒性试验。

4.8 动物种属

动物种属的要求未做变更。基于不同种属可能反应不同,从充分暴露受试物毒性的角度考虑,采用不同种属的动物进行试验可获得较为充分的安全性信息。对于化学药,单次给药毒性试验应采用至少2种哺乳动物进行试验,一般应选用1种啮齿类动物和1种非啮齿类动物。对于中药、天然药物,根据具体情况,可选择啮齿类和/或非啮齿类动物进行试验。小鼠、大鼠或犬为单次给药毒性试验常选用动物种属。

4.9 观察指标

在原指导原则观察指标的基础上,增加了扩大的单次给药毒性试验的指标内容。常规的观察指标包括:临床症状(如动物外观、行为、饮食、对刺激的反应、分泌物、排泄物等)、死亡情况(死亡时间、濒死前反应等)、体重变化(给药前、观察期结束时各称重1次,观察期间可多次称重,动物死亡或濒死时应称重)、大体解剖(必要时进行组织病理学检查)等。

指导原则说明:在一些情况下,为获得更为全面的急性毒性信息,可设计多个剂量组,观察更多的指标,如血液学指标、血液生化学指标、组织病理学检查等,以更好地确定毒性靶器官或剂量反应关系。

4.10 其他方面

关于一些具体的试验要求,如禁食时间、动物数要求、给药容量,在指导原则起草过程中,有人建议进行明确。考虑到本指导原则不再收载具体的试验方法,且不同的单次给药毒性试验方法不一致,仅写1~2个试验的要求意义不大,因此对这些具体试验操作,本指导原则未予明确。但是,在进行试验时应注意采用规范的方法,如最大给药量试验,一般情况下,动物数啮齿类每组至少20只,灌胃给药量的给药容量为小鼠40 mL~kg^-1、大鼠20 mL~kg^-1。关于单次给药毒性试验的进行时间未作变更,要求在首次人体试验前完成。

5 小结

基于当前的科学实践、研发策略改变和动物保护,国际上对单次给药毒性试验的认识不断深化,对其意义和作用提出了挑战,在其研发策略的支持下,甚至要求取消该项试验的注册要求。基于我国新药研发现状,单次给药毒性试验对于安全性评价仍具有重要意义,现阶段该试验仍作为我国新药注册申报的要求。

在进行单次给药毒性试验时,研究者应根据具体情况具体分析的原则,选择合适的试验方法。不再追求一个所谓精确的LD₅₀ 值,而是重在毒性反应的观察。鼓励从试验中获得更多的毒性信息。若从其他规范的试验中可获得急性毒性信息,可以替代单独的单次给药毒性试验。鼓励进行观察多个指标的扩大的单次给药毒性试验。

摘自:<中国新药杂志>,2015年第4期

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