原材料选择与质量控制并重

                                                   ——聚乙二醇修饰干扰素研发中需注意的药学问题

      聚乙二醇(PEG)所具有的屏障作用可以挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，从而减少免疫原性，减少体内清除率，使蛋白质不易被蛋白酶水解，有利于延长蛋白药物的半衰期。正是基于此，科学家们希望通过对干扰素进行PEG化修饰，延长半衰期，减少其免疫原性，从而提高疗效和患者的顺应性。

　　本文对聚乙二醇修饰干扰素研发中需注意的药学问题进行了分析，作者提醒：考虑到PEG修饰控制技术的复杂性和难度，建议在研发过程中特别关注PEG的选择和质控问题，并慎重考虑这类仿制研究可能面临的失败风险。望本文能给相关药物的研发以启示。

　　普通干扰素自80年代上市以来，在抗病毒、调节免疫中的疗效已得到临床肯定。但是其存在的半衰期较短、需要隔日注射的问题，给患者用药带来了不便。并且其发热、流感样症状、骨髓抑制、精神神经系统等副反应也是常见的，并且还会因多次、长期用药使机体产生抗干扰素抗体而使其疗效降低。

　　聚乙二醇(PEG)共价修饰蛋白质药物，因PEG具有空间位阻，可以作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，从而减少免疫原性，减少体内清除率，PEG的屏障作用还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解，PEG化的这些特点均有利于延长蛋白药物的半衰期。虽然这类药品的药学研究思路、研究方法和内容与其他生物制品基本一致，但是，由于这类药物是在比较成熟的干扰素制品基础上进行的PEG修饰，在进行药学研究时还应注意以下问题：

　　原材料的选择和质量控制

　　由于修饰的基团不同，需要使用不同的PEG活化产品。比如对巯基修饰需要采用PEG-马来酰亚胺，N端的α-氨基修饰需要采用PEG-醛基衍生物。此外，还要考虑PEG的分子量、PEG本身的形状（如直链或分枝状）对于干扰素空间结构，以及对体内代谢的影响问题。

　　据多家药物研究机构反映，目前国外公司PEG产品的可获得性有一定问题。因此，企业研发此类产品时需考虑PEG原料供应的持续性，确保研究和将来规模生产时原材料的一致性，以避免今后药物上市时因原材料变更而带来问题。

　　对于PEG的质量控制，第一，要关注其分子量范围，应尽可能采用分散度控制高的产品，目前建议分散度至少控制在±10%以内。第二，应注意PEG修饰剂批间分子量的一致性，有时候分子量的批间差异对产品性能的影响甚至要大于分散度对产品性能的影响。第三，还要考虑与修饰干扰素发生偶合反应的活性和选择性，以及修饰后形成的化学键的稳定性。第四，要关注PEG本身的稳定性，因为在贮存、分装和生产过程中，高温、氧化和潮解都可能使其活化基团失活，从而导致修饰效率大大降低。第五，作为基本药用标准，PEG修饰剂的端基取代率和纯度都应达到90%以上。

　　修饰位点的选择和工艺优化

　　对于修饰反应，建议首先考虑单一位点修饰；其次，如果待修饰物的序列和结构特征决定其不能避免有多个潜在修饰位点，应考虑选择修饰反应可控的位点，如通过反应条件的控制能够进行明确位点的选择性修饰。

　　同样重要的是，应注意PEG修饰后对干扰素空间结构的改变情况，例如是否会产生新的抗原表位，如果有此种情况应该避免；另外，还要注意修饰的位置应避免在干扰素的关键活性区域，比如在活性中起关键作用的二硫键等位置。

　　如果不能进行单一位点修饰，而是多位点修饰，就要注意研究这些不同修饰干扰素的性质，其对干扰素活性、免疫原性、体内代谢等的影响。然后，根据该研究结果优化PEG与干扰素偶合反应的条件（比如：控制PEG化反应溶液的pH值可相对有效地控制PEG偶合反应的方向性），并对后续偶合产物进行有针对性的纯化，尽可能得到预期的组分较单一的产品，这也是工艺优化要考虑的重点。如果位置异构体完全分离确实比较困难，至少也应该将主要位置异构体的性质和比例研究清楚，并确保不同批次间各组分比例的一致性。

　　对PEG修饰位点的结构确证是重点。要搞清楚是单一位点修饰还是多位点修饰，还要确认是在干扰素序列中哪个氨基酸的基团上进行的修饰，必要时还要进行空间结构影响的确证。目前，国内在这方面的研究方法也日渐成熟，如果企业技术力量有限，建议提前考虑与有专长的科研院所进行合作研究。

　　此外，在对产品纯度的分析中，要注意采用不同分离原理的检测方法。还要对寡聚体、游离干扰素和游离PEG进行检测，并将其纳入产品的质量标准中。

　　质量研究的重点

　　稳定性研究的考虑

　　既往，对普通干扰素的稳定性研究比较关注其活性在不同条件下放置的变化。PEG修饰的干扰素，活性也是其稳定性研究的考察重点，不仅要关注活性下降与否，也应关注活性的增强。如果其活性增强，就有可能提示PEG修饰键的稳定性较差；造成PEG与普通干扰素的分离，是干扰素的比例高了，从而活性提高（因为有研究提示，PEG修饰的干扰素体外活性要比普通干扰素低2个数量级）。除了关注活性之外，还要注意考察PEG干扰素的纯度，包括游离干扰素含量的变化。

　　国内PEG化干扰素的跟踪研究，主要借鉴了一些国外公司研发的PEG修饰干扰素成功上市的先例。基于国外制品经临床试验证明了其具有可延长半衰期、减少用药针次、提高患者抗病毒应答率等特点，以及目前已大量应用于慢性丙肝和/或乙疗的现实，国内多家企业先后申报了类似的制品，目前已有数个产品进入临床试验阶段，还有一些正在筹划或者正在开展临床前研究，拟申报临床试验。

　　考虑到PEG修饰控制技术的复杂性和难度，建议在研发过程中应特别关注PEG的选择和质控问题，并慎重考虑这类仿制研究可能面临的失败风险。

　　（作者单位：国家食品药品监督管理局药品审评中心）

来源：中国医药报